第134章 黎明前的测序(2/3)
逆转录完成。
江河深吸了一口气，换了一把p200的移液枪。
江河走到冰箱前，拿出逆转录试剂盒：“不需要特异性引物，我们在pcr阶段再用甲流通用的ha（血凝素）和na（神经氨酸酶）保守区引物去钓出目标片段。”
“我们要分别扩增它的ha基因、na基因、基因以及pb1基因片段。”
逆转录反应体系配制完毕。
这一步是整个提取过程中最关键的一步。
他将手肘支撑在台面上，按下移液枪的按钮。
五分钟一到。
“开始。”
“室温静置5分钟，让核蛋白复合体彻底解离。”
江河严肃道：“你们是我亲自教出来的，我对你们的实验规范有绝对的信心，今晚的操作，每一步都必须严格按照我教的规范来，不许有任何多余的动作，听明白了吗？”
实验室内。
“滴——”
透明的液体瞬间混合。
电脑屏幕上立刻跳出一条曲线。
轻轻悬浮沉淀后，第三次离心。
“放入离心机，配平，12000转，15分钟。”
江河小心翼翼取出离心管。
基本就等同于，拿着标准答案，反向推导解题步骤。
江河看了一眼墙上的挂钟。
“明白！”陆晓林年纪最长，第一个出声回应。
——哪怕是浸淫实验室多年的老研究员，悬空吸取水相时也难免会有细微的晃动，但江河的手就像是被焊死了一样，稳得可怕。
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枪尖精准悬停在无色水相的中央，缓缓吸取了400微升的液体，移入一个全新的无酶离心管中。
陈浩几个人长长地松了一口气，互相对视了一眼。
外科医生的定力，在这一刻展现得淋漓尽致。
这15分钟极其漫长。
“去更衣室，穿两层隔离衣，戴双层乳胶手套，n95口罩，护目镜，进核心区。”
将样本移入新的离心管中，注入trizol。
这就是培训的成果！
凌晨3:15。
“浓度120 ng/μl，a260/280比值202。”陆晓林声音迅速，“师弟，提取极其完美！纯度极高，没有蛋白和苯酚污染！”
“重点是，防止环境里的rna酶降解样本。”
做到了！
看着手里的试剂，江河眼神微动。
但他不一样。
他把箱子交给江河：“江河，这是马克的深部支气管肺泡灌洗液，已经加了裂解液灭活了。”
江河站在超净工作台前，将转运箱打开，取出装有灭活样本的冻存管。
“风干5分钟，不能干透，否则很难溶解。”
江河拿起一把p1000的移液枪，套上带滤芯的枪头。
江河：“弃上清，加1毫升75的冰乙醇洗涤沉淀。”
如果吸到了中间的蛋白层或者底层的有机相，整个样本就废了。
“准备pcr扩增反应。”
“师兄，亦舟，你们俩配合我，准备过柱子提取。”
底层是红色的酚氯仿相，中间是一层薄薄的白色蛋白交界面，最上层是无色的水相。
严肃，高效。
凌晨5:30。
全程，江河的手没有一丝颤抖。
光是引物设计就能卡死全中国最顶尖的实验室两周时间。
42c孵育60分钟，70c加热5分钟灭活逆转录酶。
“静置3分钟。”
“加入trizol试剂，1毫升。”
陆晓林在旁边看得头皮发麻。
离心机停止。
陆晓林拿着样本走到nanodrop分光光度计前，取了一微升滴在检测基座上，放下悬臂。
“第二组，程溪瑶、唐培，你们负责给所有的移液枪换上带滤芯的枪头，准备好离心管和冰盒。”
顾亦舟在一旁已经打开了高速冷冻离心机的盖子，温度已经预冷到了4c。
江河毫不犹豫，道：“立刻进行逆转录，rna极易降解，必须马上把它变成稳定的cdna。”
五分钟后，江河加入20微升rnase-free的水，轻轻吹打。
所以效率才能这么高。
“用随机六聚体引物（rando hexars）做全转录本的逆转录。”
再次取出时，管底出现了一点点半透明胶状沉淀。
“好。”
“加入等体积的异丙醇，陈浩，递冰盒。”
他记得h1n1的基因图谱，也知道它的外膜蛋白弱点，包括它最容易被哪种引物扩增。
“加氯仿，02毫升。”
在冷光的照射下，管内的液体清晰地分成了三层：
12000转，10分钟。
“引物用什么？”陆晓林问。
最后，用移液枪极其小心地吸走所有的乙醇液体，将离心管敞口放置在超净台的通风处。
柯正提着一个密封的生物安全转运箱来到了实验室门口。
极其脆弱的rna终于变成了相对稳定的dna。
“第一组，陈浩、向晚，你们负责配制试剂，所有的depc水、无水乙醇、异丙醇，全部重新开封新的，确保绝对无rna酶污染，操作台用rnasezap喷洒擦拭两遍。”
“明白了老江，你说咋干就咋干。”陈浩拍了拍脸，让自己彻底清醒。
“rna沉淀出来了。”程溪瑶隔着护目镜，眼睛亮了起来。
其实，如果这真的是一种完全未知的全新病毒，今晚的这几个小时根本连门槛都摸不到。
这群年纪轻轻的学生，此刻展现出了惊人的纪律性。
样本在冰上静置了10分钟后，再次放入冷冻离心机。
“盖紧管盖，剧烈振荡15秒。”
“去测浓度。”江河把样本递给陆晓林。
江河接过箱子，转身刷卡进入实验室核心区，立刻说道：
放入pcr仪。
所有的病毒rna，都溶解在这最上层的无色水相中。
7500转，5分钟。